建議及技巧：

用于蛋白檢測的Duolink® PLA技術(shù)可提供一種具有一系列明確定義步驟的簡易而直接的實驗方法。該章節(jié)將會對可確保Duolink® PLA實驗順利進行的一些重要注意事項進行描述。

一、前期考慮：

1.采用在待測樣品內(nèi)可具有最佳一抗性能的條件。這些條件包括樣品處理參數(shù)（固定、通透化、抗原修復(fù)等）、一抗效價以及孵育時間。

2.為了可對結(jié)果進行正確的評估，在實驗中總是需要設(shè)置技術(shù)及可用的生物學對照。

3.Duolink® PLA Control Kit是一款可對技術(shù)進行檢測并獲取成功結(jié)果的便捷工具。它包含有利 Duolink® PLA試劑進行蛋 白間相互作用觀察的帶有預(yù)鋪板細胞的顯微玻片以及一對抗體。PLA信號是具有保障的。采用該款對照試劑盒可提升Duolink® PLA技術(shù)的可靠性或為您的實驗增添更多的對照。

二、常見實驗參數(shù)：

1.永遠不要讓您的樣品變干。在加濕箱中進行孵育步驟。

2.確保去除樣品中多余的洗滌溶液。殘留的洗滌溶液會造成抗體的進一步稀釋并降低連接或擴增的效率。

3.可采用一支疏水筆將樣品圈出來。當使用孔板玻片時，這將有助于防止孔間的溶液交叉污染。當使用組織切片時，這可以將所需的試劑體積降低到低值。

4.在合適的溫度及孵育時間條件下進行所有的步驟以獲取最佳的結(jié)果，特別是酶相關(guān)的步驟（連接及擴增）。

5.在進行低豐度蛋白檢測時，可能需要將擴增時間進行延長。如果在這些條件下出現(xiàn)背景提升，可使用Duolink®Brightfield Amplification Buffer（不含有檢測寡核苷酸）獨立進行擴增和檢測步驟，并隨后采用Duolink®Fluorescent Amplification Buffer（含有檢測寡核苷酸）進行一步30分鐘的孵育。

6.在大量的洗滌溶液中進行洗滌并確保樣品被覆蓋。按要求分別使用洗滌溶液A或B。在室溫進行洗滌。

7.在使用過程中將酶放置在冰凍模塊中。確保其他的試劑解凍（如連接溶液和擴增溶液）并在使用前進行渦旋混勻。

三、樣品儲存及分析：

1.所有的® PLA探針必須儲存在4 °C；包括使用Duolink® Probemaker生成的。不要凍存，否則結(jié)果將會被顯著減弱。

2.對于熒光相關(guān)的應(yīng)用，在使用帶有DAPI的Duolink® Mounting Media進行封片后將玻片避光儲存在4 °C最長可達4天。密封儲存在-20 °C最長可達6個月。

3.不可過度曝光。熒光信號會發(fā)生聚結(jié)使得獲取準確的定量分析結(jié)果更加困難。需要注意的時，信號聚結(jié)并不會影響流式細胞分析。

4.實驗及對照樣品應(yīng)采用相同的捕獲參數(shù)進行拍照成像。

四、故障排除：

盡管注意到了所有的注意事項，也使用一些很好的建議和技巧，結(jié)果有時也不是會符合預(yù)期。陽性對照無信號以及高背景是免疫檢測實驗中最為常見的兩種問題，并在使用Duolink® PLA技術(shù)時也有可能會發(fā)生。下表列舉了這些常見問題的可能誘因以及建議的解決方案。