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ELISA（酶聯(lián)免疫吸附測定）是蛋白質(zhì)檢測的“金標(biāo)準(zhǔn)"方法。1在本博客中，回顧了三種流行的 ELISA 平臺(tái)：標(biāo)準(zhǔn) ELISA、免疫 PCR和單分子陣列 (SIMOA)。我們將對(duì)這些 ELISA 的設(shè)計(jì)原理、樣本量、儀器和靈敏度進(jìn)行比較。
ELISA的基本設(shè)計(jì)原理取決于抗體-抗原相互作用的穩(wěn)定性和特異性。簡而言之，固定在珠子或微孔板等固體基質(zhì)上的捕獲抗體可與多種樣品類型中的目標(biāo)蛋白結(jié)合。此類樣品可包括血漿、血清、細(xì)胞和組織裂解物、條件培養(yǎng)基或尿液。
1971 年引入 ELISA 時(shí)，酶標(biāo)記抗原被纖維素顆粒上的抗體捕獲。2然后通過反復(fù)離心和洗滌分離抗體-抗原綴合物。此后，不同的 ELISA 格式被開發(fā)出來，包括夾心 ELISA，其中目標(biāo)蛋白“夾在"捕獲抗體和標(biāo)記檢測抗體之間（圖 1）。這種 ELISA 格式具有高度特異性，因?yàn)?/span>需要兩種抗體與蛋白質(zhì)結(jié)合才能進(jìn)行檢測。此外，可以用標(biāo)準(zhǔn)曲線確定蛋白質(zhì)濃度（即定量數(shù)據(jù)）。
這里討論的 ELISA 平臺(tái)——標(biāo)準(zhǔn) ELISA、免疫 PCR和單分子陣列 (SIMOA) ——是生成定量數(shù)據(jù)的夾心 ELISA。然而，它們?cè)诘孜铩z測方法、儀器、樣品體積和靈敏度方面有所不同。
標(biāo)準(zhǔn) ELISA (sELISA) 將捕獲抗體固定到透明塑料 96 孔微孔板上（圖 2、表 1）。該檢測抗體與辣根過氧化物酶 (HRP) 結(jié)合，該酶可將其底物 3,3',5,5'-四甲基聯(lián)苯胺 (TMB) 還原為藍(lán)色和氧化形式。顏色的變化與 HRP 的量成正比，并且推論與樣品中目標(biāo)蛋白的量成正比。添加硫酸可終止 HRP-TMB 反應(yīng)，導(dǎo)致顏色從藍(lán)色變?yōu)辄S色。使用酶標(biāo)儀在 450 nm 處測量吸光度。
| 標(biāo)準(zhǔn) | 免疫PCR | SIMOA™ | |
|---|---|---|---|
| 基質(zhì) | 96孔微孔板 | 96孔PCR板 | 珠子 |
| 檢測方法 | 比色法 | 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) | 熒光 |
| 樂器 | 讀板器 | 實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀 | 專用儀器 |
| 樣品量* | 100微升 | 10-25 µL | 125微升 |
| 靈敏度 | 高的 | 更高 | 最高 |
表 1. 標(biāo)準(zhǔn) ELISA、免疫 PCR 和單分子陣列 (SIMOA) 的比較。 * = 樣品稀釋后每次重復(fù)的最終體積。
sELISA 的靈敏度一般范圍為 1 pg/ml 至 100 pg/ml。然而，一些 sELISA 的定量限 (LLOQ) 低至亞 pg/ml 或高達(dá) 10 ng/ml。與所有 ELISA 一樣，靈敏度取決于所用抗體的靈敏度。
對(duì)于標(biāo)準(zhǔn) 96 孔板，最終樣品體積為每孔 100 µL。使用“半面積"板可以減少體積 (50 µL) ，其中孔的直徑為一半寬，但測定靈敏度也可能會(huì)降低。用于任何ELISA 的原始樣品體積將取決于最佳樣品稀釋度，該稀釋度會(huì)因蛋白質(zhì)、樣品類型和實(shí)驗(yàn)而異。
將樣品添加到板中后，大約 5 小時(shí)內(nèi)即可獲得結(jié)果。然而，當(dāng)樣品和抗體同時(shí)添加到板中時(shí)，可以實(shí)現(xiàn)更快的周轉(zhuǎn)時(shí)間。這減少了孵育步驟和洗滌步驟的數(shù)量。例如，SpeedELISA的處理時(shí)間為 3 小時(shí)，在添加樣品之前同時(shí)孵育板上的捕獲和檢測抗體。其他方法包括一步添加樣品和兩種抗體，或者將樣品和檢測抗體一起添加。然而，減少處理時(shí)間會(huì)降低靈敏度（圖 3）。
sELISA 的主要優(yōu)點(diǎn)是提供低成本試劑盒，可以針對(duì)來自多個(gè)物種的數(shù)千種不同蛋白質(zhì)。此外，sELISA 幾乎不需要培訓(xùn)，可生成易于解釋的數(shù)據(jù)，并使用與其他檢測兼容的經(jīng)濟(jì)實(shí)惠的酶標(biāo)儀。這些優(yōu)點(diǎn)導(dǎo)致 sELISA 在研究中得到廣泛使用。
免疫 PCR也稱為免疫定量 ELISA (IQELISA)，將捕獲抗體粘附到塑料 96 孔 PCR 板上，同時(shí)檢測抗體與 DNA 條形碼綴合（圖 4、表 1）。使用 PCR，雙鏈 (ds) DNA 條形碼在條形碼特異性引物和與 dsDNA 結(jié)合的熒光染料存在的情況下分別被擴(kuò)增和染色。熒光與 dsDNA 的量成正比，因此也與樣品中目標(biāo)蛋白的量成正比。使用實(shí)時(shí) PCR 儀器測量熒光。
IQELISA 的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是其體積要求小，每次重復(fù)的最終體積僅為 10 µL。因此，當(dāng)樣品量有限或難以獲得樣品時(shí)，IQELISA 是一個(gè)特別有吸引力的選擇。然而，IQELISA 比 sELISA 在技術(shù)上更具挑戰(zhàn)性，因?yàn)樗枰_的移液。此外，樣品應(yīng)至少重復(fù)三次，因?yàn)樾◇w積會(huì)增加異常值的機(jī)會(huì)。
DNA 通過 PCR 擴(kuò)增循環(huán)呈指數(shù)增長。因此，與使用相同抗原和抗體對(duì)的 sELISA 相比，IQELISA 的 LLOQ 平均增加了 23 倍。靈敏度的增加取決于抗體，范圍從無變化到 105 倍（圖 5）。
從樣品孵育到數(shù)據(jù)收集，IQELISA 大約需要 5.5 小時(shí)。該周轉(zhuǎn)時(shí)間與 sELISA 類似。
SIMOA是一種超靈敏 ELISA，使用抗體包被的珠子和熒光偶聯(lián)的檢測抗體（圖 6、表 1）。將珠子、樣品和檢測抗體混合在一起后，將溶液施加到具有超過 235,000 個(gè)微孔的卡盒中。每個(gè)微孔只能容納一顆珠子。然后將油添加到卡盒中，將樣品推過微孔陣列的表面并形成孔的液密密封。
使用配備熒光顯微鏡的全自動(dòng)或半自動(dòng)系統(tǒng)測量熒光；該儀器由 SIMOA（ Quanterix ；Billerica，MA；美國）開發(fā)商制造。由于每個(gè)孔只能包含一個(gè)珠子，因此具有熒光的微孔的數(shù)量與樣品中目標(biāo)蛋白的量成正比。這使得單分子檢測成為可能。
SIMOA 的一個(gè)關(guān)鍵優(yōu)勢是它可以檢測飛摩爾范圍內(nèi)的蛋白質(zhì)。也就是說，靈敏度通常在 10 fg/ml 至 1 pg/ml 范圍內(nèi)。與 sELISA 和 IQELISA 相比，SIMOA 的平均靈敏度分別提高了 465 倍和 63 倍。
將試劑裝入 Quanterix 儀器后，大約需要 3 小時(shí)才能獲取數(shù)據(jù)。因此，SIMOA 的程序時(shí)間比 sELISA 和 IQELISA 都短。
雖然 SIMOA 實(shí)現(xiàn)了此處評(píng)測的三個(gè)平臺(tái)中的一些最高靈敏度，但該技術(shù)也有一些缺點(diǎn)。首先，目前使用該技術(shù)分析的蛋白質(zhì)數(shù)量很少（~165）。其次，SIMOA 試劑盒的成本高于 sELISA 和 IQELISA 試劑盒。第三，檢測儀器價(jià)格昂貴，且只能用于SIMOA，是專用儀器，需要專門培訓(xùn)才能運(yùn)行。
值得一提的是，IQELISA 和 SIMOA 分別可以同時(shí)分析多達(dá) 3 個(gè)和 6 個(gè)目標(biāo)。除了需要更少的樣品之外，在分析相同數(shù)量的蛋白質(zhì)時(shí)，多重檢測通常比單重檢測更具成本效益。重要的是，多重檢測會(huì)降低 IQELISA 的靈敏度，而使用SR-X TM生物標(biāo)志物檢測系統(tǒng)的SIMOA 則不會(huì)影響靈敏度。
還提供其他定量多重 ELISA 選項(xiàng)，包括 Quantibody® 和 RayPlex TM 抗體陣列。Quantibody可以使用 100 µL 稀釋樣品在 6 小時(shí)內(nèi)分析多達(dá) 40 種蛋白質(zhì)，一式四份。使用兼容的激光掃描儀采集數(shù)據(jù)。RayPlex可以使用流式細(xì)胞術(shù)在 4 小時(shí)內(nèi)每次重復(fù)使用 25 µL 稀釋樣品測量多達(dá) 25 種蛋白質(zhì)。兩種抗體陣列的靈敏度與 sELISA 相似。
在我們的博客“使用抗體陣列進(jìn)行多重蛋白質(zhì)檢測"或我們的視頻“為您的研究識(shí)別正確的抗體陣列"中了解如何確定用于多重蛋白質(zhì)檢測的正確抗體陣列。
標(biāo)準(zhǔn) ELISA、免疫 PCR (IQELISA) 和 SIMOA 相互比較時(shí)具有優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn)：
sELISA是一種簡單的比色測定法，數(shù)據(jù)易于解釋，因此幾乎不需要培訓(xùn)。使用能夠測量 450 nm 吸光度的酶標(biāo)儀在 5 小時(shí)內(nèi)獲得數(shù)據(jù)。使用比 IQELISA 和 SIMOA 試劑盒便宜的試劑盒可以靶向數(shù)千種不同的蛋白質(zhì)。然而，與 IQELISA 和 SIMOA 相比，sELISA 的靈敏度低。
免疫PCR使用實(shí)時(shí)PCR儀器，在6小時(shí)內(nèi)收集數(shù)據(jù)。在此介紹的三個(gè) ELISA 平臺(tái)中，它的體積要求低，但比 sELISA 需要更多的移液和數(shù)據(jù)分析技術(shù)專業(yè)知識(shí)。平均而言，其靈敏度比 sELISA 高 23 倍。可以同時(shí)檢測 3 種蛋白質(zhì)，但檢測靈敏度會(huì)降低。
SIMOA的靈敏度最高，其靈敏度平均分別比 sELISA 和 IQELISA 提高了 465 倍和 63 倍。使用需要專門培訓(xùn)的昂貴專用儀器可在 3 小時(shí)內(nèi)獲得數(shù)據(jù)。它還需要比 sELISA 和 IQELISA 更多的樣本量。一次可以分析多達(dá) 6 種蛋白質(zhì)，而不會(huì)影響靈敏度。
圖 8 表明，對(duì)于許多蛋白質(zhì)，LLOQ 的總體改進(jìn)遵循以下趨勢：SIMOA > IQELISA > sELISA。不過，也有例外。例如，IQELISA 對(duì)人 IL-1β 的靈敏度最高，為 0.0064 pg/ml，而 sELISA 和 SIMOA 的 LLOQ 分別為 0.3 和 0.04 pg/ml。
最常見的蛋白質(zhì)檢測工具之一是 ELISA。在這里，我們比較了三種流行的夾心 ELISA 平臺(tái)：標(biāo)準(zhǔn) ELISA、免疫 PCR和單分子陣列 (SIMOA)。在為研究選擇合適的 ELISA 時(shí)，其底物、檢測方法、儀器、樣品量、靈敏度和成本是重要的考慮因素。標(biāo)準(zhǔn) ELISA 是流行的方法，因?yàn)?/span> 可以使用低成本 試劑盒來靶向來自多個(gè)物種的數(shù)千種不同蛋白質(zhì)。此外，它幾乎不需要培訓(xùn)即可運(yùn)行，其數(shù)據(jù)易于解釋，并且使用非專用 酶標(biāo)儀 與其他測定兼容。一個(gè)關(guān)鍵要點(diǎn)是 ELISA 靈敏度和成本之間需要權(quán)衡：靈敏度越高，成本越高。成本考慮了套件、培訓(xùn)、勞動(dòng)力和所需儀器的價(jià)格。因此，sELISA 是實(shí)惠的選擇，而 SIMOA 是最敏感的。
對(duì)于不具備必要的專業(yè)知識(shí)或設(shè)備來使用此處討論的 ELISA 平臺(tái)分析樣品的實(shí)驗(yàn)室，RayBiotech Life, Inc. 提供完整的測試服務(wù)。該服務(wù)提供完整的報(bào)告，包括原始數(shù)據(jù)、標(biāo)準(zhǔn)曲線和定量數(shù)據(jù)。蛋白質(zhì)濃度。
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